熒光探劑與激光掃描共焦顯微術(shù)

　　激光掃描共焦顯微術(shù)的基本原理是，在細胞內(nèi)一個任意選定的深度上將激光束聚焦成線度接近單個分子的極小的斑點，并在細胞內(nèi)一定深度的層面上進行掃描，通過光學系統(tǒng)，即可得到細胞一個層面的清晰圖象。連續(xù)改變激光的聚焦深度，在一系列的層面上進行掃描，最后獲得整個細胞的三維圖象。利用目前已達上千種與細胞內(nèi)不同分子（或離子）特異性結(jié)合的熒光探針，人們就可以直接觀測活細胞中各種重要生物分子的位置、運動以及與其它分子的相互作用等。例如觀測細胞骨架上的微管、微絲與中間纖維，觀察信號轉(zhuǎn)導通路上的各種重要的酶與信使分子，還可利用基因重組技術(shù)將自身已有的熒光蛋白引入細胞，用激光掃描共焦顯微鏡研究基因的表達、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用與細胞內(nèi)的交通等。熒光探針和熒光蛋白與激光共焦顯微術(shù)的結(jié)合，使人們能夠看到細胞內(nèi)一個既復雜又異彩紛呈的世界。

　　多光子熒光成像技術(shù)

　　目前，共焦顯微成像術(shù)使用的是可見光波段的氬離子激光器，因此可能引起活細胞的損傷。利用多光子，如多光子激發(fā)，至少有以下三個優(yōu)點：一是由于近紅外光激發(fā)，故對活細胞的損傷大大減??；二是在組織中由于近紅外光比可見光的透光率高，因此可觀測樣品中更深層的熒光成像；三是許多用在可見區(qū)甚至紫區(qū)的熒光探劑照樣可以使用。這種技術(shù)主要是使用高強度紅外激光，使雙光子的激發(fā)效率與短波長的單光子相當。現(xiàn)在已有一些激光器滿足這一要求。

　　光鉗和單分子操作

　　光鉗（Opticaltweezer）技術(shù)誕生于20世紀80年代，發(fā)展于90年代。其基本原理是：當一個微粒（如一個與生物大分子結(jié)合的硅珠）處于一個強度按高斯分布的激光光束中時，由于光場強度的空間變化，光束將對微粒產(chǎn)生一種梯度壓力，驅(qū)使其移向光束中心，并使其穩(wěn)定在那里。這樣，激光束就似鉗子將粒子牢牢地鉗住，并令其隨光束人為地移動。光鉗施加在微粒上的壓力取決于光的波長、光束的寬度及功率等。當激光器的功率為幾毫瓦到幾瓦時，施加于尺寸為微米大小的微粒上的力大約為幾個到幾百皮(10-10)牛頓。為了不使激光被生物組織強烈吸收，為了不使激光被生物組織強烈吸收，光鉗一般使用近紅外激光器光源。光鉗技術(shù)的重要應(yīng)用是，用以研究和觀測與肌肉收縮、細胞分裂、蛋白質(zhì)合成等密切相關(guān)的一類蛋白質(zhì)分子馬達。研究時，將一個微米大小的硅珠或聚苯乙烯珠與這些分子馬達接在一起，在顯微鏡下用光鉗鉗住小珠，啟動分子馬達，就可以測量出分子馬達運動時產(chǎn)生的力。德國學者已經(jīng)用激光在卵細胞膜上打孔，用光鉗將精子抓住并送入卵細胞，大大提高了體外受精的成功率。今后，新一代的光鉗將具備施力的反饋機制，使光鉗加在捕捉的離子上的力能改變其大小，從而研究影響分子馬達的各種因素。光鉗還可以用來對細胞進行各種加工等。因此，光鉗將在細胞工程技術(shù)方面發(fā)揮重要的作用。