2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術(shù)概要　顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術(shù)的需要而進行的。所謂顯微鏡檢術(shù)（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術(shù)與方法。以下簡述顯微鏡檢術(shù)中已成熟的幾種方法及對應(yīng)的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。

 　　(1) 透射光明視野（brightfield）　這是自顯微鏡發(fā)明以來最傳統(tǒng)、最普遍的應(yīng)用方法。 
基本部件：

　　a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察；

　　b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。

　　調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應(yīng)用明視野法。

　　適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。

　　注意事項：

　　a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好；

 　　b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中；

　　c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)；

　　d. 作顯微照相時，每換用一個倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。

　　(2) 透射光相差法（phase-contrast）　這是現(xiàn)代顯微鏡檢術(shù)中的一種反差增強法。

　　基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片。

　　調(diào)整方法：

 　　a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎(chǔ)上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰；

　　b. 把聚光鏡轉(zhuǎn)到Ph1對準轉(zhuǎn)盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品；

　　c. 拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）；#p#分頁標題#e#

　　d. 視野中的兩個相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉(zhuǎn)鈕），使透光環(huán)作前后左右移動而與黑環(huán)重合；

　　e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像；

　　f. 有20×和40×物鏡觀察時，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph2位置上，用100物鏡時，聚光鏡應(yīng)設(shè)在Ph3位置上。

　　適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

　　(3) 微分干涉相襯法（differential interference-contrast，DIC）　為了克服相差法觀察時樣品細節(jié)像周圍伴隨有光暈，會掩沒掉本來應(yīng)該看見的細節(jié)，以及樣品或組織切片厚度要求相當薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設(shè)計子微分干涉相襯法。

　　調(diào)整方法：

　　a. 必須在庫勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎(chǔ)上才能調(diào)好DIC方法；

　　b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置；

　　c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應(yīng)為東—西方向；

　　d. 把聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)到與10×物鏡對應(yīng)使用的位置上，即DIC 0.3—0.4；

　　e. 在物鏡后方或物鏡轉(zhuǎn)換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DIC slider）；

　　f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應(yīng)為南—北方；

　　g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調(diào)焦清晰； 　

　　h. 調(diào)節(jié)DIC插片，使微分干涉相襯的像達到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯；

　　i. 同時可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達到最佳；

　　j. 然后再細微調(diào)樣品的細節(jié)，可見樣品中不同層面上的結(jié)構(gòu)；

　　k. 如果把補色器（first order red retardation plate）插入，并同時調(diào)節(jié)DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能#p#分頁標題#e# 
染色的組織切片，厚度可達100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細胞、小生生物等。

　　(4) 落射光激發(fā)的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）　簡稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。

        熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。

　　調(diào)整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。

　?、?汞燈的安裝

　　a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側(cè)或右側(cè)；

 　　b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定；

　　c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應(yīng)的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上；

　　d. 詳細的安裝方法請參照有關(guān)說明書。

　?、?汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整：

　　a. 接通汞燈電源，讓汞燈預(yù)熱10-15min；

　　b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線；

　　c. 轉(zhuǎn)動燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上；

　　d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量靠近，但不要重疊在一起。

　?、?汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗：#p#分頁標題#e#

　　a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場光闌開到最大；

　　b. 把熒光濾光片組推到藍光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍光太刺眼；

　　c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙；

　　d. 取下一個物鏡，使激發(fā)的藍光經(jīng)物鏡轉(zhuǎn)換器的空檔照在白紙上，白紙上會有一藍色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應(yīng)該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置；

 　　e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光；

　　f. 仔細調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。

　?、?汞燈使用注意事項　目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點燃時，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使 用汞燈。

　　a. 汞燈接通電源后需要10-15min預(yù)熱時間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此，觀察前要提早通電；

　　b. 汞燈在使用過程中，不要隨意開關(guān)汞燈的電源；

　　c. 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時，將會造成嚴重后果。由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內(nèi)阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強大的電流，輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個實驗室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件；

　　d. 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當可達600h，使用壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，應(yīng)集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價格及昂貴，應(yīng)珍惜使用；

 　　e. 汞燈壽命終結(jié)的標志是點燃困難，燈管發(fā)黑。

　　5. 暗視野法（dark field）　許多透明或半透明的樣品，如細菌、微生物、細胞內(nèi)的精細結(jié)構(gòu)及結(jié)晶體的內(nèi)含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細節(jié)。

　　普遍光學(xué)顯微鏡的最高分辨率為0.2?m，而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細節(jié)構(gòu)造分辨不清楚，但卻可看到0.004?m以上微細顆粒的存在，即可以看到亞顯微結(jié)構(gòu)，特別適合用來觀察微細的顆粒與細菌等。

　　調(diào)整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好。換上暗視野聚光鏡時，要把載玻片（樣品）移開，將浸沒油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物臺上，浸沒油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光只能透過光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進入聚光鏡內(nèi)。#p#分頁標題#e#

　　對于配備齊全的相差顯微鏡，與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán)，可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。

　　光學(xué)顯微鏡的保養(yǎng)    
 
　　顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器，價格普遍較高。從結(jié)構(gòu)上看，顯微鏡由許多光學(xué)部件和較精密的金屬零件組成，在使用過程中應(yīng)特別注意做好保養(yǎng)工作。

　　1. 嚴格按照有關(guān)操作規(guī)則使用顯微鏡，避免因使用不當造成損毀。

　　2. 顯微鏡在儲存和使用過程中，普遍存在著生霉起霧問題，霉和霧會使顯微鏡的視場模糊，分辯率下降。為了使顯微鏡保持良好的工作狀態(tài)，延長使用壽命，顯微鏡的工作環(huán)境應(yīng)保持清潔、干燥、防塵。

　　3. 顯微鏡在每次使用完畢后應(yīng)及時做好清潔工作，特別是目鏡、物鏡等容易污染的光學(xué)部件，如發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)表面有灰塵、指紋、臟物等，應(yīng)及時用鏡頭紙清潔干凈。

　　4. 顯微鏡工作室最好能安裝空調(diào)、抽濕及防塵裝置。

　　5. 如發(fā)現(xiàn)光學(xué)部件內(nèi)部有生霉等現(xiàn)象，最好及時聯(lián)系有關(guān)廠家派人清潔、維修。