本文介紹了一種以紅光半導體激光器作為熒光激發(fā)光源，結合光纖光譜技術測量水體中葉綠素α濃度的新方法。通過分析葉綠素α的激光光致發(fā)光機理，得出了水體中葉綠素α熒光發(fā)射光譜的相對熒光峰值強度與葉綠素α濃度的近似線性關系。實驗結果表明，在紅光半導體激光器激勵下根據(jù)葉綠素α的熒光發(fā)射光譜直觀地判斷葉綠素α的濃度這種方法完全可行，由此為研制葉綠素α熒光儀提供了一種新的光源選擇，并為實現(xiàn)現(xiàn)場實時監(jiān)測海水中葉綠素α濃度提供了實驗依據(jù)。

　　隨著國內經(jīng)濟的飛速發(fā)展，污染越來越嚴重，環(huán)境問題越來越受到人們的關注。水是人類賴以生存的物質基礎，水質的好壞直接關系到人類的生存和健康。浮游植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級生產(chǎn)者和能量的主要轉換者，浮游植物生物量的多少決定了海區(qū)內生態(tài)系統(tǒng)的群落結構和能量分布狀態(tài)。因此，海水中浮游植物的濃度是判斷水質好壞的重要依據(jù)。通常采用測量水體中葉綠素α濃度的方法來獲得海水中浮游植物的濃度。由于水體中葉綠素α的濃度反映了浮游植物的濃度，因此是環(huán)保部門監(jiān)測水質狀況的重要指標之一，同時還可通過海水中葉綠素α濃來估算海洋初級生產(chǎn)力。因此，水體中葉綠素α濃度的測量就顯得尤為重要。

　　長期以來，對水體中葉綠素α濃度的常用測量方法主要有分光光度法和熒光分析法兩種。無論哪種方法，由于葉綠素熒光信號很弱，需要一個高強度、無背景干擾且穩(wěn)定輸出的激勵光源；而人們采用的激勵光源多為傳統(tǒng)的復色光源(包括汞燈、氙燈、各種等離子體光源等)，需要采取濾光、信號放大、去噪聲等一系列措施，這無疑使系統(tǒng)結構變得復雜，不利于現(xiàn)場實時測量。而由于激光具有很高的能量峰值和很窄的脈沖寬度，一般由激光誘導熒光測量物質的特性比由一般光源誘導熒光所測的靈敏度提高2倍～10倍。目前國內外已有一些研究者采用激光作為激勵光源，但普遍采用能耗較高且價格昂貴的藍綠光。現(xiàn)率先采用低能耗的紅光半導體激光器作為激勵光源，并結合光纖光譜技術以提高接受信號的能力，最終使系統(tǒng)具有高靈敏度、低能耗、小型化、易集成化等特點。

　　1.理論分析

　　當特定波長的光子(單色激發(fā)光)被所照射的分子吸收后，分子的電子能級發(fā)生躍遷而處于激發(fā)態(tài)，而激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在適當條件下如果這部分被吸收的能量又以輻射形式重新回到基態(tài)，這就是光致發(fā)光。對于葉綠素分子來說，當葉綠素α分子部分或全部吸收其特征吸收波段的光子，就由最穩(wěn)定的、能量最低的狀態(tài)-基態(tài)上升到不穩(wěn)定的高能狀態(tài)-激發(fā)態(tài)，而激發(fā)態(tài)分子極不穩(wěn)定，會在極短的時間內(10-12s)無輻射躍遷到亞穩(wěn)態(tài)能級，處于亞穩(wěn)態(tài)的電子躍遷到基態(tài)(10-8s)并釋放出熒光。

        葉綠素α分子有紅光和藍光兩個最強吸收區(qū)，由于它吸收的光能有一部分消耗在分子內部的振動上，且熒光又總是從第一單線態(tài)的最低振動能級輻射的，輻射出的光能必定低于吸收的光能，因此葉綠素的熒光的波長總要比被吸收的波長長些。葉綠素α在吸收特定波長的激發(fā)光后發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的熒光，通常直觀地用葉綠素α的熒光發(fā)射光譜來描述。只要激勵光的光強穩(wěn)定，熒光光強僅與葉綠素α的濃度有關。對水體中的葉綠素α來說，在某一特定波長的光激發(fā)后，所發(fā)射的熒光強度為：

　　式(1)中：k為儀器常數(shù)；Q為物質熒光效率；I0為激勵光光強；c為物質濃度；b為樣品光程差；ε為摩爾吸收系數(shù)。當所測量的熒光物質確定后，k，Q，I0，b，ε均為常數(shù)，則c與F成一定數(shù)學關系。對上式進行分析可知，當溶液很稀時，εcb很小，則上式指數(shù)部分近似為1-εcb，相應的F=kQI0εbc=ωc(其中ω=kQI0εb，在激勵光光強穩(wěn)定時是常數(shù))，即此時葉綠素α濃度與相對熒光光強近似成線性關系。因此在同一穩(wěn)定的激發(fā)光激勵下，可以根據(jù)葉綠素α的熒光發(fā)射光譜方便直觀地判斷葉綠素α的濃度。

2.實驗方法與數(shù)據(jù)分析

　　實驗中采用激光誘導熒光(LIF)與光纖光譜技術結合來測量水體中葉綠素α的熒光發(fā)射光譜。實驗所用主要儀器有：美國海洋光學公司生產(chǎn)的HR-2000系列光纖光譜儀，輸出功率10mW的紅光半導體激光器(660nm)，計算機，量筒，無水乙醇，器皿等。實驗裝置示意圖如圖1所示：

　　實驗具體過程如下：用圖1所示實驗裝置先測得不放葉綠素樣品時乙醇溶液在激光照射下的透射光譜，如圖2所示；采集新鮮樹葉若干，剪碎研磨后用高純度的無水乙醇5ml配成標準溶液，濃度記為c0，用相同實驗裝置測得該濃度下葉綠素α的熒光發(fā)射光譜，相對熒光峰值強度記為F0；然后逐步添加無水乙醇稀釋成6ml、8ml和10ml的三種不同濃度的溶液，稀釋后的溶液濃度依次記為5c0/6、5c0/8和c0/2，用相同的方法分別測得不同濃度下對應的熒光發(fā)射光譜，相應的熒光峰值強度記為F1、F2和F3，測得熒光發(fā)射光譜和實驗中獲得的數(shù)據(jù)分別如圖3，表1所示：

　　比較圖2，圖3可以看出，圖2只有一個峰(660nm)，實際上是激勵光的光譜。兩者區(qū)別在于加入葉綠素樣品后在685nm附近明顯出現(xiàn)了一個熒光峰，由此可以判斷其為葉綠素α所產(chǎn)生的熒光。由于不同濃度的葉綠素α在685nm處均有一個明顯的熒光發(fā)射峰，且峰值強度隨濃度的減小而降低；兩者的具體關系通過分析表1中數(shù)據(jù)可看出，葉綠素α的相對熒光峰值強度與其濃度近似成線性，這與理論相吻合，因此可以通過獲取葉綠素α的熒光發(fā)射光譜來估算水體中葉綠素α的濃度。

3.結論

　　首次提出用紅光半導體激光照射葉綠素α溶液產(chǎn)生光致發(fā)光的新方法，通過實驗觀察到熒光光譜的峰值波長在685nm附近，且峰值高度與葉綠素濃度近似成線性關系，為實現(xiàn)現(xiàn)場監(jiān)測海水中葉綠素α的濃度提供了理論和實驗依據(jù)。這種方法的優(yōu)點是：只需探測熒光光譜中685nm峰值的相對強度，即可快速測定葉綠素α的濃度；由于采用紅光半導體激光作為激發(fā)光源，避免了對熒光發(fā)射光譜造成背景噪聲，因此靈敏度高，精確性好，克服了傳統(tǒng)方法的局限性；此外，半導體激光器體積小、功耗低，便于研制集成化的測量儀器。