人體的新陳代謝功能是通過(guò)復(fù)雜的、分級(jí)三維（3D）血管網(wǎng)絡(luò)輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及清除廢物來(lái)維持的。分級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)最大限度地增加了代謝物擴(kuò)散的表面積，同時(shí)也最大限度地減少了流體對(duì)流的阻力。因此，通過(guò)工程化手段體外構(gòu)建分層血管網(wǎng)絡(luò)是體外重構(gòu)組織器官的基礎(chǔ)。

近日，美國(guó)萊斯大學(xué)Jordan S. Miller團(tuán)隊(duì)在Nature Biomedical Engineering期刊發(fā)表題為“Generation of Model Tissues with Dendritic Vascular Networks via Sacrificial Laser-sintered Carbohydrate Templates”的文章，報(bào)道了使用糖粉犧牲材料結(jié)合激光燒結(jié)技術(shù)制造樹(shù)突狀網(wǎng)絡(luò)支架，然后灌注載細(xì)胞水凝膠構(gòu)建樹(shù)突狀血管網(wǎng)絡(luò)組織模型。這項(xiàng)研究證明樹(shù)突血管網(wǎng)絡(luò)可以維持超過(guò)1cm厚的組織模型中細(xì)胞代謝活性，為研究血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)和組織功能之間的關(guān)系提供了新的模型策略。

背景介紹

血管網(wǎng)絡(luò)是人體的重要組成部分，保證組織器官的營(yíng)養(yǎng)和氧氣的供應(yīng)。較早的研究采用軟光刻和插針管的方式構(gòu)建血管通道，隨著工程技術(shù)的發(fā)展和新材料的出現(xiàn)而逐漸淘汰，目前的研究手段聚焦于增材制造在血管化模型構(gòu)建中的應(yīng)用。構(gòu)建給定的血管化通道可以通過(guò)噴墨、擠出工藝，懸浮打印工藝，立體光刻工藝，激光燒結(jié)等技術(shù)實(shí)現(xiàn)。其中激光燒結(jié)技術(shù)指以激光為熱源對(duì)粉末壓坯進(jìn)行燒結(jié)的技術(shù)，具有成型速度快、精度高等優(yōu)勢(shì)，非常適合構(gòu)建復(fù)雜血管通道。Jordan S. Miller團(tuán)隊(duì)模擬生理狀態(tài)下血管分支結(jié)構(gòu)，利用激光燒結(jié)技術(shù)將糖粉材料燒結(jié)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的糖支架。然后用水凝膠包裹糖支架，在給定條件下溶解該支架形成空腔，最后在空腔內(nèi)灌注血管內(nèi)皮細(xì)胞形成完整的樹(shù)突狀血管網(wǎng)模型。利用燒結(jié)技術(shù)可以構(gòu)建諸如分層網(wǎng)絡(luò)等復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，既為體外長(zhǎng)期培養(yǎng)大尺度組織模型提供新的解決方案，也為研究血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在組織代謝中的功能提供可能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.基于糖犧牲材料的激光燒結(jié)技術(shù)流程

實(shí)驗(yàn)中使用的是糖犧牲材料的基礎(chǔ)成分是異麥芽粉（Isomalt powder），但是異麥芽粉與標(biāo)準(zhǔn)激光燒結(jié)材料（如尼龍）相比具有更高的粘性（圖1d），需混合抗凝結(jié)劑（二氧化硅，玉米淀粉和黃原膠）以稀釋其粘性。然后糖粉末由粉末分裝器和振動(dòng)篩槽均勻地噴灑在指定區(qū)域，通過(guò)激光燒結(jié)構(gòu)筑成型（圖1a）。所構(gòu)建的糖支架具有異質(zhì)3D分支，曲率光滑和無(wú)支撐幾何體的特性（圖1b）。該支架同時(shí)具有一定的硬度和脆性，其彈性模量約為600MPa，足以支撐其自身重量并完成后續(xù)的水凝膠灌注。該團(tuán)隊(duì)還更新了OpenSLS的硬件和固件，使其能編碼區(qū)域特定的燒結(jié)參數(shù)，更適合進(jìn)行糖粉的激光燒結(jié)（圖1e）。

2.基于糖犧牲材料的激光燒結(jié)技術(shù)后處理和特性表征

燒結(jié)后的糖支架表面顆粒感強(qiáng)，使用濃縮異麥芽糖溶液處理后可以快速抹平表面而不會(huì)影響整個(gè)結(jié)構(gòu)（圖1f）。接下來(lái)，該團(tuán)隊(duì)評(píng)估了激光參數(shù)和幾何結(jié)構(gòu)之間關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)了從厘米（圖1b，圖1c）到百微米（圖1g）范圍內(nèi)的糖支架制造參數(shù)。尤其糖絲直徑在400 -800微米范圍內(nèi)，固定功率密度為45Wmm2時(shí)，激光移動(dòng)速度和糖絲直徑之間存在近似線性關(guān)系（圖1g，圖1h）。

圖1. 基于激光燒結(jié)技術(shù)的糖支架設(shè)備搭建和制作流程。

3.基于激光燒結(jié)技術(shù)的糖支架犧牲性檢測(cè)

為驗(yàn)證燒結(jié)并光滑處理后的糖材料具有犧牲性，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)燒結(jié)制作簡(jiǎn)單的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，然后用不同的材料包裹網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。在外殼材料凝固后，加水或者PBS溶解糖材料。結(jié)果表明，糖材料可被PDMS、PCL、PEGDA、瓊脂、絲素蛋白、纖維蛋白等多種材料或水凝膠包裹，并且溶解后的管道均有良好的連通性（圖2a - 圖2c）。然后該團(tuán)隊(duì)制造嘗試構(gòu)建復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在可控性較差的瓊脂材料中分別成功構(gòu)建了二維多通道、三維分層通道和三維獨(dú)立通道等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了基于糖粉末的激光燒結(jié)技術(shù)具有在多種水凝膠中構(gòu)建復(fù)雜血管通道的可能。

圖2. 燒結(jié)后糖支架在分支網(wǎng)絡(luò)和多血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的犧牲性檢測(cè)。

4.樹(shù)突狀血管網(wǎng)設(shè)計(jì)

為模擬生理?xiàng)l件下的動(dòng)脈-靜脈血管網(wǎng)絡(luò)，該團(tuán)隊(duì)采用了葉脈分支模型來(lái)計(jì)算分支血管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)言之，在一個(gè)橢圓模型內(nèi)假定兩個(gè)葉脈生長(zhǎng)點(diǎn)并假定其隨機(jī)延伸（圖3a），當(dāng)兩個(gè)生長(zhǎng)束接近時(shí)，它們的末端分支相互吸引（圖3b）并會(huì)聚形成閉合網(wǎng)絡(luò)（圖3c）。但是網(wǎng)絡(luò)管道厚度的計(jì)算遵從Murray定律而獨(dú)立于葉脈網(wǎng)絡(luò)生長(zhǎng)步驟（圖3d）。經(jīng)過(guò)對(duì)該網(wǎng)絡(luò)的流動(dòng)性評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)可以有效地將流量分布在所有通道中（圖3e），即分叉的流體在分支中呈現(xiàn)出較低的速度，而會(huì)聚的流體獲得速度則是分支速度之和（圖3f）。另外，研究結(jié)果表明通道中的最大速度和壁面剪應(yīng)力是一致的，證明了整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的流體流動(dòng)是均勻分布的（圖3g）。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算流體力學(xué)（CFD）可模擬上述流動(dòng)性評(píng)估結(jié)果，于是提出了將CFD用于模擬和預(yù)測(cè)血管流動(dòng)性的可能。文章作者最后通過(guò)檢查三個(gè)單獨(dú)的粒子圖像測(cè)速（PIV）實(shí)驗(yàn)，證明了該網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的可重復(fù)性（圖3i，圖3j）。

圖3. 基于葉脈分支模型的樹(shù)突狀血管網(wǎng)絡(luò)模擬。

5.激光燒結(jié)糖支架血管網(wǎng)絡(luò)載細(xì)胞培養(yǎng)

在獲得穩(wěn)定構(gòu)建血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的工藝參數(shù)后，該團(tuán)隊(duì)開(kāi)始進(jìn)行載細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。血管網(wǎng)外層水凝膠中混有被mOrange標(biāo)記的IMR-90成纖維細(xì)胞，血管通道內(nèi)皮通過(guò)灌注種植GFP標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）。經(jīng)過(guò)11天的灌注培養(yǎng)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HUVEC在管腔內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好，并有向水凝膠內(nèi)萌發(fā)的趨勢(shì)。進(jìn)一步的評(píng)估表明，HUVEC均勻地覆蓋在網(wǎng)絡(luò)的各個(gè)分支（圖4c，圖4d）和通道的整個(gè)周長(zhǎng)（圖4e）周?chē)?。接下?lái)，該團(tuán)隊(duì)在同一個(gè)血管網(wǎng)糖支架上的不同區(qū)域用不同的水凝膠包裹，構(gòu)建出一個(gè)液體互通的異源材料血管網(wǎng)組織模型，證明了糖支架激光燒結(jié)技術(shù)在構(gòu)建不同組織交界面模型的潛力（圖4f）。

圖4. 糖支架血管網(wǎng)絡(luò)具有良好的細(xì)胞培養(yǎng)活性。

6.載細(xì)胞水凝膠中細(xì)胞代謝的區(qū)域異質(zhì)性

為深入了解灌注水凝膠中不同細(xì)胞密度下的代謝活性，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)激光燒結(jié)技術(shù)制造單管道水凝膠（圖5a）。水凝膠中混合不同密度的HepG2肝細(xì)胞，在第0天、第3天、第7天后通過(guò)MTT染色研究細(xì)胞代謝活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靠近單管道的細(xì)胞一直維持較高的代謝活性而其他區(qū)域的代謝活性從第3天開(kāi)始減弱（圖5b，c）。對(duì)低細(xì)胞密度水凝膠的研究顯示，從第3天開(kāi)始管道附近的細(xì)胞密度、代謝活性（圖5d，圖5e）開(kāi)始加速上升，而高細(xì)胞密度水凝膠中第3天和第7天的細(xì)胞密度沒(méi)有顯著變化，可能原因是水凝膠中細(xì)胞密度過(guò)高而很快達(dá)到飽和。同時(shí)第7天的結(jié)果還表明，在不同細(xì)胞密度的水凝膠中其代謝活性半徑和總代謝水平隨著時(shí)間的推移趨于相同（圖5f，圖5g），并總結(jié)了細(xì)胞活性與通道距離之間的簡(jiǎn)單函數(shù)關(guān)系（圖5h）。

圖5. 載細(xì)胞水凝膠中細(xì)胞代謝活性評(píng)估。

7.載細(xì)胞水凝膠樹(shù)突狀血管網(wǎng)灌注培養(yǎng)研究

該團(tuán)隊(duì)同樣通過(guò)燒結(jié)技術(shù)構(gòu)建樹(shù)突狀血管網(wǎng)支架并包埋于2%瓊脂糖膠中，并驗(yàn)證了該結(jié)構(gòu)的通道流動(dòng)性（圖6a – 圖6d）。然后，將該支架包埋于載HepG2細(xì)胞的水凝膠中，觀察到3天后樹(shù)突狀網(wǎng)絡(luò)周?chē)?xì)胞代謝活性增強(qiáng)（圖6e）。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了一個(gè)圖像處理工作流程，將整個(gè)凝膠的代謝活動(dòng)進(jìn)行可視化，并發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀血管網(wǎng)存在灌注不充分的區(qū)域。其可能原因是該區(qū)域上游管道本身灌注不足導(dǎo)致的（圖6f – 圖6h）。

圖6. 樹(shù)突狀血管網(wǎng)絡(luò)的制備、灌注和載細(xì)胞培養(yǎng)分析。

8.樹(shù)突狀血管網(wǎng)絡(luò)灌注培養(yǎng)支持原代肝細(xì)胞維持代謝活性

首先，該團(tuán)隊(duì)制作簡(jiǎn)單的多通道水凝膠，水凝膠中植入小鼠原代肝細(xì)胞。相比于靜態(tài)培養(yǎng)，通過(guò)灌注培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞維持更高的代謝活性和更真實(shí)的蛋白表達(dá)，細(xì)胞之間的間隙也更為緊密，同時(shí)也表達(dá)更高的白蛋白水平（圖7a-圖7g）。然后，該團(tuán)隊(duì)制作了1.5cmx 3.8cm大尺度樹(shù)突狀網(wǎng)絡(luò)培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞（圖h）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞主要聚集在管道周?chē)L(zhǎng)（圖7i，圖7j），這些細(xì)胞在培養(yǎng)7天后細(xì)胞仍然維持白蛋白分泌功能和緊密的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)（圖7l – 圖7n）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該團(tuán)簇代謝活性在培養(yǎng)3天達(dá)到最高，培養(yǎng)7天后出現(xiàn)明顯下降。同時(shí)E-cadherin表達(dá)檢測(cè)也證實(shí)了代謝的變化（圖7j，圖7k）。

圖7. 樹(shù)突狀血管網(wǎng)絡(luò)灌注支持原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)。

總結(jié)

在這項(xiàng)研究中，Jordan S.Miller團(tuán)隊(duì)證明了通過(guò)激光燒結(jié)制作的糖支架可被用于構(gòu)建復(fù)雜的通道網(wǎng)絡(luò)用于模擬人體的血管系統(tǒng)。該技術(shù)采用犧牲材料灌注的方法構(gòu)建水凝膠結(jié)構(gòu)，使得體外構(gòu)建任意血管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)成為可能。激光燒結(jié)技術(shù)克服了擠壓技術(shù)在復(fù)雜結(jié)構(gòu)和多層結(jié)構(gòu)上的制造限制，從而實(shí)現(xiàn)具有仿生功能的三維分級(jí)、分支血管網(wǎng)絡(luò)。

參考文獻(xiàn)

Generationof model tissues with dendritic vascular networks via sacrificiallaser-sintered carbohydrate templates[J]. Nature Biomedical Engineering, 2020:1-17.

DOI：10.1038/s41551-020-0566-1